藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基
無(wú)添加成分的MH瓊脂，適用于非苛養(yǎng)菌。
添加5%機(jī)械脫纖維馬血及20 mg/ Lβ-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD)的MH瓊脂(MH-F,Mueller-Hinton Fastidious),適用于苛養(yǎng)菌。
β-NAD純度≥98%。

自制培養(yǎng)基

MH-F培養(yǎng)基需在冷卻至42-45℃后再添加血液或β-NAD，然后充分混勻。
在水平面上傾注平板，培養(yǎng)基厚度4.0±0.5 mm.如果瓊脂厚度在可接受范圍內(nèi)但持續(xù)高于或低于4mm，則需調(diào)整瓊脂體積。
不同平板所需的培養(yǎng)基大致體積：90mm圓形平板25ml,100mm圓形平板31ml，150mm圓形平板71ml,100mm方形平板40ml。制造商之間平板尺寸可能不同。應(yīng)基于所使用的培養(yǎng)皿真實(shí)尺寸，計(jì)算出所需培養(yǎng)基正確的體積。

MH瓊脂平板質(zhì)量控制
檢測(cè)每個(gè)新批次MH瓊脂平板，確保所有抗菌藥物抑菌圈都在EUCAST質(zhì)量控制范圍之內(nèi)。
特殊問(wèn)題:
1、銅綠假單胞菌ATCC 27853對(duì)氨基糖苷類藥物的抑菌圈低于/超出質(zhì)控下限或上限，表明二價(jià)陽(yáng)離子濃度過(guò)高或過(guò)低。
2、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑?qū)S腸球菌ATCC 29212的抑菌圈范圍低于質(zhì)控下限，表明胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷在培養(yǎng)基中濃度過(guò)高。

瓊脂平板干燥和儲(chǔ)存
1、自制平板：4-8℃儲(chǔ)存。平板的干燥、儲(chǔ)存條件及有效期根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況而定。
2、商品化平板：按照制造商建議儲(chǔ)存。在標(biāo)注的有效期之內(nèi)使用

瓊脂平板干燥和儲(chǔ)存
確保瓊脂平板在接種前恢復(fù)至室溫。
瓊脂表面使用前應(yīng)干燥。
過(guò)多的水分可能引起抑菌圈邊緣模糊和/或抑菌圈內(nèi)部薄霧狀生長(zhǎng)。
瓊脂表面或蓋子里面不應(yīng)看見(jiàn)水滴。當(dāng)用塑料袋或密封容器儲(chǔ)存平板時(shí)經(jīng)常看見(jiàn)這種情況。
必要時(shí)可以20-25℃過(guò)夜干燥平板，或者打開蓋子35℃放置15分鐘。
不要過(guò)度干燥平板。

接種物

該方法需要相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液 大約相當(dāng)于1-2×108CFU/mL的大腸埃希菌

接種物制備

使用無(wú)菌環(huán)或棉拭子從非選擇性培養(yǎng)基上挑選過(guò)夜培養(yǎng)的菌落。如果可能，挑選幾個(gè)形態(tài)相似的菌落，避免選擇不典型的變異株。
在鹽水中混懸并混勻。通過(guò)添加鹽水或挑取更多的細(xì)菌來(lái)調(diào)整菌懸液至0.5麥?zhǔn)蠞岫取Ｗ詈檬褂帽葷醿x來(lái)測(cè)量濁度。
例外：血瓊脂平板上的肺炎鏈球菌混懸至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋煽肆Ν傊桨迳系姆窝祖溓蚓鷳?yīng)混懸至1.0麥?zhǔn)蠞岫?/span>

平板接種

制備的菌懸液最好在15分鐘內(nèi)使用，通常在60分鐘之內(nèi)使用。確保平板在接種前恢復(fù)至室溫。用無(wú)菌棉拭子蘸取菌懸液。對(duì)于革蘭陰性細(xì)菌，可以通過(guò)在管壁內(nèi)側(cè)按壓和旋轉(zhuǎn)拭子來(lái)去除多余液體，避免過(guò)量接種。對(duì)于革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，不要在管壁內(nèi)側(cè)按壓或旋轉(zhuǎn)拭子

藥敏紙片的儲(chǔ)存

按照制造商說(shuō)明書保存未開封紙片和正在使用的紙片。有些藥物相對(duì)其它藥物更不穩(wěn)定，可能有特殊的保存推薦規(guī)范。正在使用的紙片應(yīng)置于含干燥指示劑的密閉容器內(nèi)，避光保存。為了防止冷凝，在打開容器前讓紙片恢復(fù)至室溫。如果一天當(dāng)中多次使用藥敏紙片，室溫保存要優(yōu)于反復(fù)凍融。不要使用超過(guò)廠商規(guī)定有效期的紙片。

藥敏紙片的使用
接種15分鐘內(nèi)貼紙片。紙片必須緊貼在瓊脂表面。為了避免抑菌圈的重疊和藥物之間的相互干擾，應(yīng)當(dāng)限制平板上貼的紙片數(shù)量。重要的是能夠可靠地測(cè)量抑菌圈直徑。

平板的孵育
翻轉(zhuǎn)瓊脂平板以確定紙片不會(huì)從瓊脂表面脫落。在貼紙片后15分鐘內(nèi)，孵育平板。由于受熱不均勻，在孵育箱內(nèi)疊放平板可能會(huì)影響結(jié)果。盡管培養(yǎng)箱性能不同，但對(duì)于大多數(shù)培養(yǎng)箱來(lái)說(shuō)，每堆最多放5個(gè)平板較為合適。
35±1℃空氣孵育MH平板。
35±1℃4-6%CO孵育MH-F平板(彎曲菌例外)

平板的孵育

15-15-15分鐘原則

紙片擴(kuò)散法操作請(qǐng)按照以下說(shuō)明：

菌懸液最好在制備后15分鐘內(nèi)接種，通常不得超過(guò)60分鐘。

接種后15分鐘內(nèi)貼紙片。

貼紙片后15分鐘內(nèi)孵育平板。

孵育后平板的檢查

正確接種和完美劃線會(huì)使菌落均勻生長(zhǎng)。生長(zhǎng)物在瓊脂表面均勻分布才能形成規(guī)整的圓形(非鋸齒狀)抑菌圈。如果見(jiàn)到單個(gè)菌落，說(shuō)明接種物濃度太低，必須重復(fù)試驗(yàn)。

抑菌圈判讀

將平板置于距眼睛約30厘米處，用肉眼判讀完全抑制處為抑菌圈邊緣。將MH平板置于黑色背景，用反射光照明，從平板背面判讀。判讀MH-F平板，用反射光照明，移開蓋子，從正面判讀

除非另有說(shuō)明，不要使用透射光(將平板朝向光源)或放大鏡。當(dāng)難以確定抑菌圈的邊緣時(shí)，將平板與工作臺(tái)成45度角放置后再閱讀可能有助于判讀。采用直尺或游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，四舍五入到毫米數(shù)。如果使用自動(dòng)抑菌圈判讀儀，必須和手工判讀法校準(zhǔn)。如果出現(xiàn)雙圈，或在抑菌圈內(nèi)有明顯的差異菌落時(shí)，應(yīng)檢查菌落純度，如有必要?jiǎng)t重復(fù)試驗(yàn)。如果是純培養(yǎng)，測(cè)量直徑時(shí)應(yīng)考慮抑菌圈內(nèi)的菌落。

抑菌圈判讀-特殊情況

抑菌圈解釋

在進(jìn)行結(jié)果解釋之前，檢查質(zhì)控菌抑菌圈直徑在可接受范圍內(nèi)。

根據(jù)目前的EU CAST折點(diǎn)表格，將抑菌圈直徑解釋敏感性分類(敏感、中介和耐藥) 。或者使用含EU CAST折點(diǎn)的模板進(jìn)行報(bào)告。

藥物敏感性試驗(yàn)的質(zhì)量控制

使用推薦的常規(guī)質(zhì)控菌株來(lái)監(jiān)測(cè)試驗(yàn)性能。

對(duì)于β-內(nèi)酰胺類抑制劑復(fù)合紙片，推薦特定的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株用于抑制劑成分的質(zhì)量控制。這應(yīng)是常規(guī)質(zhì)量控制的一部分。活性成分可采用敏感的質(zhì)控菌株來(lái)檢測(cè)。

具有明確耐藥機(jī)制的質(zhì)控菌株可用于確定其檢測(cè)耐藥性的能力。

質(zhì)控菌株可從菌株保藏中心或商業(yè)來(lái)源購(gòu)買。

使用常規(guī)質(zhì)控菌株評(píng)估常規(guī)操作

作為常規(guī)藥敏報(bào)告的抗菌藥物，應(yīng)每天做質(zhì)控試驗(yàn)或者每周至少四次。

在對(duì)臨床菌株報(bào)告結(jié)果前，應(yīng)先判讀和評(píng)估質(zhì)控試驗(yàn)結(jié)果。

每天進(jìn)行質(zhì)控實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)檢查最近的20個(gè)連續(xù)測(cè)試結(jié)果。

檢查質(zhì)控結(jié)果的趨勢(shì)以及是否有抑菌圈持續(xù)高于或低于靶值的情況。

20次測(cè)試中，如有2個(gè)或更多測(cè)試結(jié)果超出質(zhì)控范圍，應(yīng)進(jìn)行調(diào)查。

對(duì)失控結(jié)果的處理

如果20次測(cè)試中出現(xiàn)兩次非連續(xù)的抑菌圈直徑結(jié)果失控—那么報(bào)告藥敏試驗(yàn)結(jié)果，并進(jìn)行調(diào)查。

如果20次測(cè)試中出現(xiàn)兩次連續(xù)的抑菌圈直徑結(jié)果失控那么報(bào)告藥敏試驗(yàn)結(jié)果之前要先調(diào)查。這些測(cè)試可能需要復(fù)檢。

如果在某一天多個(gè)藥敏紙片(>2)失控—那么報(bào)告藥敏試驗(yàn)結(jié)果之前要先調(diào)查。這些測(cè)試可能需要復(fù)檢。

如果耐藥質(zhì)控菌株未檢測(cè)出耐藥性一那么禁止報(bào)告藥敏試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行調(diào)查并重復(fù)測(cè)試

質(zhì)控菌株的保存和傳代

質(zhì)控菌株用含磁珠甘油肉湯保存管(或市售等效培養(yǎng)基)-70°C保存。每種菌株保存2管，一管使用，一管存檔。

每周從使用管中將菌株傳代到合適的非選擇性培養(yǎng)基上，并檢查純度。

每天從已純化的平板傳代。挑取幾個(gè)菌落以避免選擇突變株。苛養(yǎng)菌只能逐日連續(xù)傳代培養(yǎng)。

QC菌株最多可傳代6天。然后，中制備新的純化平板。丟棄平板，再?gòu)睦鋬龅氖褂霉?/span>

使用管菌株用完后，從存檔保存管傳代，并用傳代培養(yǎng)物制備另一個(gè)使用管